Dados do Trabalho

Título

VALIDAÇAO DE UMA METODOLOGIA DE SEQUENCIAMENTO DE CDNA COMO FERRAMENTA COMPLEMENTAR NO DIAGNOSTICO MOLECULAR DO COMPLEXO DA ESCLEROSE TUBEROSA

Fundamentação/Introdução

Introdução/Fundamentos: A maioria dos testes genéticos em pacientes com complexo da esclerose tuberosa (TSC) é realizada por sequenciamento de nova geração (NGS) em amostras de DNA, e abrange regiões codificantes e pequenas porções dos introns dos genes TSC1 e TSC2. Com esta estratégia, 3-7% dos pacientes apresentam variantes de significado incerto (VUS) e 10-15% não apresentam variantes, o que prejudica o seu acompanhamento adequado.

Objetivos

Objetivo: Validar uma metodologia complementar ao sequenciamento de nova geração para identificar variantes nos pacientes com resultado negativo ou verificar o papel das VUS.

Delineamento e Métodos

Delineamento e Métodos: Estudo prospectivo experimental. Foram recrutados três indivíduos com VUS e um com resultado negativo de NGS, todos com suspeita clínica de TSC. Um tubo de sangue total foi coletado de cada indivíduo para separação de leucócitos, os quais foram cultivados, expandidos e tratados com puromicina. Após, foi realizada a extração de RNA total e conversão para DNA codificante (cDNA). Como o cDNA não possui íntrons, diferente do DNA, foram desenhados primers específicos para amplificar os exons dos genes TSC1 e TSC2 em blocos. O tamanho dos amplicons foi verificado em eletroforese em gel de agarose 2% por 2 horas. As bandas com tamanho diferente do esperado foram purificadas e sequenciadas pelo método de Sanger. Um cDNA comercial sem alterações foi utilizado como controle.

Resultados

Resultados: A metodologia de cDNA revelou a inclusão de nove pares de base do intron 7 no RNA mensageiro de TSC1 deste indivíduo, levando à produção de uma proteína truncada. Cinco familiares deste paciente foram analisados: um familiar com suspeita clínica de TSC também apresentou a variante e a alteração em cDNA; os demais familiares não possuem manifestações clínicas de TSC, e não apresentaram a variante e alterações de cDNA. Não foram detectadas alterações no cDNA controle.

Conclusões/Considerações Finais

Conclusões/Considerações finais: A metodologia proposta pode ser utilizada para a detecção de alterações no processamento de RNA mensageiro em amostras de cDNA. As análises de cDNA e de segregação permitiram a reclassificação da variante c.664-10T>C para patogênica. Esta variante foi identificada pela primeira vez na população gaúcha, mas ainda não tinha papel identificado. O método também foi validado com amostras controle e possui custo baixo, tendo potencial importante no diagnóstico molecular de doenças raras.

Palavras Chave

Esclerose tuberosa, sequenciamento de cDNA, sequenciamento de nova geração, validação.

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