Dados do Trabalho

Título

EFETIVIDADE DE ENSAIOS RT-QPCR MULTIPLEX IN HOUSE PARA O DIAGNÓSTICO DA COVID-19 E IMPLEMENTAÇÃO EM UM LABORATÓRIO DE REFERÊNCIA

Fundamentação/ Introdução

O teste padrão-ouro para o diagnóstico da COVID-19 é a detecção do RNA do SARS-CoV-2, através da técnica de reação em cadeia da polimerase via transcrição reversa em tempo real (RT-qPCR). O diagnóstico da doença é imprescindível para o direcionamento de medidas de prevenção e controle.

Objetivos

Buscando otimizar o diagnóstico da COVID-19, este estudo experimental objetivou desenvolver e avaliar a efetividade de dois ensaios de RT-qPCR multiplex in house para o diagnóstico da COVID-19 e implementar um dos ensaios em uma rotina laboratorial.

Delineamento e Métodos

Foram incluídas no estudo, 213 amostras de RNA, previamente testadas em um protocolo padrão de RT-qPCR singleplex. No ensaio 1 (n=113) foram avaliados os primers para o gene do nucleocapsídeo, N1 e N2 (CDC EUA) e no ensaio 2 (n=100), os primers N2 (CDC EUA) e o gene do envelope, E (Charité). Todas as reações de RT-qPCR multiplex foram realizadas utilizando o SuperScript™ III Platinum™ One-Step, com um volume final de reação de 15µL, sendo 7,5 µL de tampão 2X, 0,125 µM de sonda, 0,5 µM de primers direto e reverso, 0,2 µL de enzima, 0,03 µM de ROX, 2,17 µM de MgSO4 e 4 µL de RNA (100-200ng). A amplificação foi realizada em placas de 96 poços no QuantStudio™ Real-Time PCR, totalizando 1h15min através das seguintes condições: 15 minutos a 50ºC para a transcrição reversa, 2 minutos a 95ºC e 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC e 30 segundos a 60ºC.

Resultados

No ensaio 1 e 2 foi obtida uma eficiência de reação de 95,63% (N1) e 103,96% (N2), e 97,69% (alvo N2) e 97,88% (alvo E), respectivamente. Para ambos os ensaios, o LoD obtido foi 10 cópias de RNA/µL e a concordância com o resultado das amostras clínicas foi de 98% (n=110/113 no ensaio 1 e n=98/100 no ensaio 2). As amostras que apresentaram discordância possuíam valores de cycle threshold (Ct) próximos a 40, o que pode não ser reprodutível, devido a sensibilidade da técnica ou a baixa carga viral nas amostras. O ensaio 1, de RT-qPCR multiplex para os alvos N1 e N2 foi implementado na rotina de diagnóstico de um laboratório de referência através da testagem de 2.015 amostras de swabs naso/orofaríngeos. Destas, apenas sete (0,35%) exigiram repetição.

Conclusões/ Considerações Finais

Foi possível demonstrar a efetividade de ambos os ensaios RT-qPCR multiplex in house desenvolvidos, sendo boas alternativas para o diagnóstico da COVID-19. Ainda, a abordagem utilizando os alvos N1 e N2 em um rotina laboratorial demonstrou ser prática e fornecer resultados confiáveis.

Palavras-Chave

SARS-CoV-2, nucleocapsídeo, envelope.