I Congresso Sul Brasileiro de Biomedicina

Dados do Trabalho


Título

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE UMA METODOLOGIA ANALÍTICA PARA A DETERMINAÇÃO DE 25-HIDROXIVITAMINA D3 EM SALIVA POR LC-MS/MS

Fundamentação/Introdução

A vitamina D é um hormônio esteroide que participa de diversos processos biológicos, cuja deficiência tem sido relacionada ao desenvolvimento de doenças, os seus níveis são realizados a partir da quantificação sérica do metabólito 25-hidroxivitamina D3 (25(OH)D3). Estima-se que a fração livre 25(OH)D3 seja apenas 0,1% da sua totalidade, onde segundo a hipótese do hormônio livre, proteínas da fração livre são capazes de entrar nas células e exercer seus efeitos biológicos. A saliva tem sido proposta como uma amostra alternativa na determinação de frações livres de fármacos, surge então a proposição do uso dela como amostra complementar na dosagem de 25(OH)D3.

Objetivos

Desenvolver e validar uma metodologia analítica para determinação da 25OHD3 em amostras de saliva empregando a cromatografia líquida de alta eficiência associada à espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS).

Delineamento e Métodos

As amostras controle e calibradores foram preparadas com a adição do padrão de 25(OH)D3 em saliva sintética em diferentes concentrações. Para a análise, 1 ml da amostra foi adicionado de 50 ul de padrão interno (25OHD3-D6 0,15 ng/mL) e 2 mL de acetonitrila. Após, realizada extração em fase sólida em cartucho Strata X, ambientado com metanol e água. Após aplicação da amostra diluída em acetonitrila, foi realizada lavagem com água e com uma solução metanol:água (7:3;V:V). O extrato foi eluído com duas alíquotas de 0,7 ml de acetato de etila, e evaporado a 45°C. Posteriormente derivatizado com 4-fenil-1,2,4-triazolina-3,5-diona (PTAD) à 0,5 ng/mL durante 15 min a 48 °C, seguido de precipitação com 40 ul de etanol e nova evaporação. Retomado com 70 µl de fase móvel e 10 µl injetados no LC-MS/MS. A separação realizada em coluna Acquity BEH C18 (150 x 2,1 mm, 1,7 μm), a fase móvel 0,1% de ácido fórmico em água e 0,1% de ácido fórmico em metanol (25:75, v/v), à 0,2 mL min-1.Utilizou-se uma fonte de ionização electrospray (EIS) no modo positivo, monitorando as transições de quantificação (m/z) 298→558 e 298→564 para 25(OH)D3 e PI respectivamente.

Resultados

O tempo de corrida foi de 5 minutos, com retenção da 25(OH)D3 e PI em 3,11 e 3,9 min respectivamente. Sendo linear entre 1 e 100 pg/ml (r2=0,999),preciso CV <15% intra e inter ensaio e exato (95%), com rendimento da extração de 79% e o efeito matriz de -9%.

Conclusões/Considerações Finais

A metodologia empregada demonstrou ser precisa, exata, sensível e reprodutível, podendo ser aplicada em amostras clínicas.

Palavras-chave

25 hidroxivitamina D3; saliva; validação; LC-MS/MS

Área

Tema livre

Autores

Andiara do Carmo Artmann, Marina Venzon Antunes, Mayara Bernardes, Rafael Linden