Dados do Trabalho

Título

PADRONIZAÇAO DE TECNICA DE EXTRAÇAO DE DNA GENOMICO PARA DIFERENTES ESPECIES DE LEVEDURA, DESENHO DE METODO IN HOUSE DE EXTRAÇAO.

Fundamentação/Introdução

Técnicas para extração de material genético são muito utilizadas em laboratórios, principalmente com o advento de kits comerciais de extração. Porém, muitas vezes em experimentação, técnicas in house são necessárias visando um maior rendimento, qualidade, integridade do material genético e menor custo. As metodologias in house são adaptações de protocolos e padronização de kits comerciais para atender a realidade dos laboratórios. Geralmente é difícil obter DNA fúngico de boa qualidade, principalmente devido a estrutura compacta da parede celular que consiste de quitina, (1-3) - β -D-glucano, (1,6) - β -glucanas, lipídeos, peptídeos e às vezes melanina, que são resistentes à digestão enzimática e à degradação química.

Objetivos

Padronizar uma extração de DNA genômico de leveduras com a utilização de enzima.

Delineamento e Métodos

Foram utilizados para o teste, Candida albicans ATCC 90028 , C. tropicalis ATCC 750 , C. glabrata ATCC 2001, C. parapsilosis ATCC 22019 mais 20 isolados clínicos identificados como C. albicans de diferentes sítios anatômicos e dois isolados clínicos de Rhodotorula mucilaginosa. Um pool de colônias das leveduras foi adicionado ao caldo SDB (37 °C/18 h). Após a incubação, foram centrifugadas, ressuspensas em PBS pH 7,4 e lavadas duas vezes. O pellet foi ressuspenso em tampão de lise contendo a liticase e incubado a 37 °C por 45 a 60 minutos em um agitador rotativo. Os lisados foram tratados com SDS e proteinase K, incubados a 52-59 °C por 60 min. O DNA então, foi extraído com volume igual da mistura contendo fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25: 24: 1, pH 8,0) e precipitado com acetato de sódio 3M; o pellet lavado com etanol 70% gelado e ressuspenso em água ultrapura. O DNA genômico final foi quantificado em espectrofotômetro e sua pureza avaliada pela razão 260/280 nm.

Resultados

Foi obtido DNA em boa qualidade e quantidade em todos os isolados, não houveram diferenças entre as espécies de Candida e os isolados de R. mucilaginosa, variando de 700 a 100 ng/μl e razão 260/280 variando de 1,6 a 2,1.

Conclusões/Considerações Finais

A utilização de enzima digestiva em baixa concentração favorece a extração do material genético de leveduras por técnicas in house, igualando-se a eficiências de kits comerciais, com custo mais acessível.

Referências

Palavras-chave

Extração de DNA, Liticase, Leveduras, Técnicas in house.

Área

Tema livre