Dados do Trabalho

Título

SILENCIAMENTO GENICO DO TRANSPORTADOR GLUTAMATERGICO GLT-1 EM CULTURA DE ASTROCITOS ADULTOS

Fundamentação/Introdução

O glutamato, principal neurotransmissor excitatório, é uma molécula ímpar na complexidade cerebral. Sua concentração extracelular é controlada principalmente por astrócitos, células gliais que possuem diversas funções, entre elas, garantir a homeostasia cerebral. Astrócitos expressam o Transportador de Glutamato tipo 1 (GLT-1), a principal proteína envolvida na captação do glutamato extracelular no cérebro adulto. O silenciamento gênico constitui uma estratégia poderosa para compreender o impacto de uma proteína nos sistemas biológicos, sendo o silenciamento do GLT-1 uma ferramenta promissora na compreensão do funcionamento cerebral.

Objetivos

Validar as sequências de dois plasmídeos codificadores de shRNA para silenciamento de GLT-1.

Delineamento e Métodos

Neste estudo experimental, utilizamos ratos Wistar adultos (90 dias, n = 18) para preparo de cultivo astrocitário primário a partir de córtex cerebral. Na confluência, as culturas foram transfectadas utilizando-se Lipofectamina 3000 e os plasmídeos GLT-1-1 e GLT-1-2 por 24h. Após confirmação da redução do mRNA por qRT-PCR, as células transfectadas foram utilizadas para verificar a captação de D-Aspartato (D-Asp) através de ensaio radioativo. Os resultados foram submetidos à ANOVA de uma via e p < 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

Inicialmente, observamos uma redução significativa na quantidade de mRNA de GLT-1 na incubação com ambos plasmídeos após 72h: GLT-1-1 2500 ng, redução de ~75% p=0,028 e GLT-1-2 1500 ng, redução de ~65%, p=0,006; n=3. Células incubadas com ambos plasmídeos por 48h na concentração 500 ng apresentaram redução na captação de D-Asp (GLT-1-1: redução de ~30%, p=0,025, e GLT-1-2 redução de ~39%, p=0,029; n=3).

Conclusões/Considerações Finais

Este estudo está em andamento, entretanto, conseguimos determinar sequências de shRNA capazes de promover o silenciamento gênico do transportador glutamatérgico GLT-1 in vitro. As células tratadas apresentaram redução significativa no mRNA, indicando que os plasmídeos possuem efetividade estrutural, sendo também capazes de reduzir a função do transportador. A validação destas sequências é de grande importância por possibilitar a criação de vetores virais e o consequente silenciamento da proteína in vivo, o que possibilitará o uso de abordagens modernas e de alto poder translacional para compreensão do funcionamento cerebral.

Palavras-chave

astrocitos; silenciamento genico; glutamato.