Dados do Trabalho

Título

AVALIAÇAO DA VIABILIDADE DE SEMENTES DE TRES ESPECIES DE CYRTOPODIUM (ORCHIDACEAE) EM DIFERENTES CONDIÇOES DE PRE-CONDICIONAMENTO E DILUIÇOES DE TETRAZOLIO.

Introdução

Orchidaceae é a segunda maior família botânica, com 27.801 espécies distribuídas em todos os continentes, exceto na Antártica (Dressler 1981; The Plant List 2013). Espécies desta família são usadas principalmente como plantas ornamentais, e em menor escala para fins medicinais e culinários (Hinsley et al. 2018). Em estudo realizado por Carvalho et al. (2013), foi verificado que Orchidaceae lidera o esforço de pesquisa em plantas ornamentais no Brasil, com 31,2% dos trabalhos publicados em Congressos de flores e plantas ornamentais. Neste estudo apurou-se que os gêneros de orquídeas nativas mais estudados foram: Cattleya, (56,1%), Epidendrum (6,1%) e Oncidium e Catasetum, ambos com 4%, não tendo sido registrado nenhum estudo para Cyrtopodium. Este gênero possui além de potencial farmacológico (Silva et al. 2013), potencial ornamental (Hunhoff et al. 2016), porém ainda sem produção agrícola significativa.
Em razão da ausência de endosperma e de relação micotrófica obrigatória (Dressler 1981), comercialmente as sementes de orquídeas são germinadas assimbioticamente em condições estéreis com emprego de meios de cultura compostos por nutrientes orgânicos e inorgânicos (Arditti 2008). Os custos relativos à semeadura são elevados, e por isso, a semeadura de sementes inviáveis ou de baixo vigor deve ser evitada (Stancato et al. 2001). O método mais difundido na avaliação da viabilidade de sementes de orquídeas é o teste de coloração com o emprego do cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio (TTC), ou simplesmente tetrazólio (Vujanovic et al. 2000). Este método apresenta muitas vantagens, tais como: rapidez na obtenção do resultado (menos de 20 h para a maioria das culturas), uso de equipamentos simples e baratos e facilidade na contagem das sementes viáveis (França-Neto & Krzyzanowski 2019). Apesar da eficiência do teste, o resultado pode ser afetado por inúmeros fatores, dentre eles: características intrínsecas da semente, como dureza da testa e presença de substâncias cerosas e/ou lipídicas na superfície (Custódio et al. 2016), que dificultam a coloração; erro no preparo da solução (Soares et al. 2014) ou ainda condições inadequadas de armazenamento (Hosomi et al. 2012). Uma maneira de tornar o teste do TTC mais eficiente é submeter as sementes a pré-condicionamentos anteriores à coloração, como embebição em solução de sacarose (Hosomi et al. 2017). Assim, o escopo do trabalho foi estimar a viabilidade de sementes de três espécies de Cyrtopodium nativas do Cerrado (C. parviflorum Lindl., C. virescens Rchb. F. & Warm. e C. withneri L.C. Menezes) e verificar o protocolo mais eficiente para essa avaliação.

Resumo

Sementes de orquídea são muito diminutas e não possuem endosperma. Em razão disso, a germinação de suas sementes, para fins científicos ou comercial, é realizada in vitro em condições assépticas. A semeadura in vitro dispende quantia significativa de recursos financeiros. Assim, para evitar o uso de meio de cultura com sementes inviáveis, é recomendável avaliar a viabilidade de sementes antes da semeadura. Uma maneira de se fazer essa avaliação é por meio da embebição das sementes em solução de cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio (TTC), ou simplesmente tetrazólio. Esse sal permite avaliar, em poucas horas, a viabilidade de sementes. Entretanto, já foi verificado que a eficácia de coloração do TTC depende de características intrínsecas das sementes (impermeabilidade da testa, revestimento por substâncias graxas, etc), por isso, alguns tipos de pré-condicionamento das sementes, antes da coloração com TTC podem melhorar a eficácia do teste. Desse modo, o escopo deste trabalho foi avaliar a viabilidade de sementes de três espécies de Cyrtopodium: C. parviflorum, C. virescens e C. withneri, com o emprego de TTC. Foram avaliados dois tipos de pré-condicionamentos: embebição em solução de sacarose a 10% e em água destilada. A coloração foi testada com duas soluções: TTC a 1% diluído em água e em tampão de fosfato. Para as espécies estudadas foi verificado que o protocolo que apresentou o melhor resultado para a análise de viabilidade das sementes, foi aquele com pré-condicionamento em solução de sacarose a 10% e posterior coloração em TTC diluído em água destilada.

Objetivos

Assim, o escopo do trabalho foi estimar a viabilidade de sementes de três espécies de Cyrtopodium nativas do Cerrado (C. parviflorum Lindl., C. virescens Rchb. F. & Warm. e C. withneri L.C. Menezes) e verificar o protocolo mais eficiente para essa avaliação.

Material e Método

A viabilidade das sementes armazenadas foi avaliada pelo teste do tetrazólio. Foram testados dois tipos de pré-condicionamento e dois tipos de soluções de TTC. Os pré-condicionamentos consistiram em deixar as sementes em água destilada ou em solução de sacarose a 10% por 24 h em temperatura ambiente (Hosomi et al. 2012). Após esse período, a solução usada no pré-condicionamento foi descartada e substituída por dois tipos de solução de TTC a 1%: diluído em água destilada ou em tampão de fosfato, onde permaneceram também por 24 h no escuro e em temperatura ambiente (Soares et al. 2014; Hosomi et al. 2017). A solução de tampão de fosfato foi preparada de acordo com Souza (1994).
A contagem das sementes coradas foi feita em lâminas de vidro, e observadas em estereomicroscópio. As sementes que se encontravam no sobrenadante foram descartadas. A montagem das lâminas foi adaptada de Dutra et al. (2009) e Hosomi et al. (2017), e consistiu em adicionar ca. 165 μL de água destilada sobre a lâmina, diluir cerca de 30 μL de sementes tratadas, e cobrir com lamínula. Foi usado papel milimetrado para delimitar quatro campos de 5 x 5 mm, para contagem das sementes coradas. O sorteio dos campos foi realizado com o emprego da função “ALEATORIOENTRE” do software Microsoft Excel®. Para cada tratamento foram feitas duas repetições, e para cada repetição foram feitas duas lâminas. Cada repetição consistiu de um microtubo de 2 mL com 20 mg de sementes. Tanto para o pré-condicionamento quanto para a coloração foram usados 1,5 mL de solução.
Foram usadas sementes dessecadas com conteúdo de umidade entre 4-6% e armazenadas entre -20 e -18 ºC (Seaton & Pritchard 2001; Seaton 2007; Hosomi et al. 2017). O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Cultura de Tecidos do CRAD/UnB (Centro de Referência em Conservação da Natureza e Recuperação de Áreas Degradas da Universidade de Brasília-DF). As percentagens foram transformadas para valores angulares (arcoseno√

Resultados e discussão

Os dados obtidos mostram que o tipo de pré-condicionamento e a coloração influenciaram diretamente o resultado da viabilidade das sementes (Tabela 1). Para C. parviflorum, a embebição em sacarose a 10% (T3 e T4) afetou positivamente o resultado do teste, não havendo diferença no tipo de coloração. No caso de C. virescens, a coloração direta em TTC diluído em água sem embebição anterior (T5) produziu o maior valor de viabilidade. E por fim, foi observado que em C. withneri o pré-condicionamento em sacarose a 10% e coloração com TTC diluído em água (T4) foi protocolo com melhor resultado.
Na literatura há bastante variação nos resultados sobre testes de viabilidade com TTC. Hosomi et al. (2012) verificaram que o pré-condicionamento em solução de sacarose a 10% produziu maior resposta ao teste. Já Soares et al. (2014) observaram que a coloração com TTC diluído em tampão de fosfatos produziu melhor resposta, mas uma das seis espécies estudadas não respondeu ao teste. Em outro trabalho, Soares et al. (2021) estudaram duas espécies de orquídeas do Cerrado: Miltonia flavescens Lindl. e Schomburgkia crispa Lindl. A primeira respondeu melhor ao pré-condicionamento com sacarose a 10% e incubação a 40 ºC, e a outra respondeu positivamente a várias condições de pré-condicionamento e incubação. No trabalho aqui apresentado foi observado que algumas sementes apresentavam bolhas de ar em seu interior, e isso pode ter afetado negativamente o resultado de alguns tratamentos.
Apesar de ser rápido e eficiente, o teste do TTC apresenta algumas limitações, além de ser afetado por condições intrínsecas da própria semente e por tratamentos pelos quais as sementes foram submetidas (França-Neto & Krzyzanowski 2019).

Conclusões/Considerações Finais

Para as espécies estudadas foi verificado que o protocolo que apresentou o melhor resultado para a análise de viabilidade das sementes, foi aquele com pré-condicionamento em solução de sacarose a 10% e posterior coloração em TTC diluído em água destilada.

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Palavras Chave

Cyrtopodium, Orchidaceae, pré-condicionamento, tetrazólio

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